脂联素干预糖尿病牙周炎模型小鼠牙周组织及血浆中的脂联素水平

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1315

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脂联素(Adiponectin/ADPN)：是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，是一种胰岛素增敏激素，能改善小鼠的胰岛素抗性和动脉硬化症；对人体的研究发现，脂联素水平能预示2型糖尿病和冠心病的发展，并在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力。
晚期糖基化终末产物(advanced glycationend products，AGEs)：是过量的糖和蛋白质结合的产物，在体内有2个来源，一是过量的糖和蛋白质在体内合成晚期糖基化终末产物，二是通过进食将食物中存在的晚期糖基化终末产物摄入体内。晚期糖基化终末产物能够和身体的组织细胞相组合并破坏它们。目前的研究证明：晚期糖基化终末产物会加速人体的衰老和导致很多慢性退化型疾病的发生。

摘要
背景：低水平表达的脂联素在牙周炎和糖尿病的发生与发展进程之中均发挥着明显的促进作用。
目的：探讨脂联素注射对糖尿病并发牙周炎病理模型小鼠的治疗作用及其机制。
方法：60只8周龄的昆明系小鼠，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供。小鼠被平均随机分为3组，其中模型组和脂联素组中所有小鼠均接受一次性的链脲佐菌素腹腔注射从而建立小鼠糖尿病模型，于牙周结扎部位涂抹联合菌液以建立小鼠牙周炎模型。正常对照组和糖尿病牙周炎模型组小鼠每日1次接受1 mL生理盐水腹腔注射，脂联素组小鼠则每日接受1次15 μg/kg的脂联素腹腔注射。治疗持续6周，酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清及牙周组织中脂联素的水平、血糖及血浆胰岛素的水平；观察小鼠的牙周探诊深度以及牙槽骨垂直吸收高度；苏木精-伊红染色检测牙周组织病理变化；TUNEL法检测牙龈上皮细胞凋亡水平变化，RT-PCR和Western blot检测RAGE、活性氧基因和蛋白表达。
结果与结论：①脂联素组小鼠的血清和牙周组织中的脂联素水平较正常对照组和模型组明显升高(P < 0.05)；②脂联素组较模型组小鼠血糖水平明显降低(P < 0.05)，血清胰岛素水平明显升高(P < 0.05)；③脂联素组小鼠的牙周探诊深度和牙槽骨垂直吸收高度较模型组明显减轻，牙龈上皮细胞凋亡率也明显降低；④RAGE、活性氧基因和蛋白表达水平脂联素组较模型组明显减轻(P < 0.05)；⑤结果说明，脂联素干预可以提高糖尿病牙周炎病理模型小鼠牙周组织及血浆的脂联素水平，并可以明显改善小鼠的血糖状态；减轻小鼠牙周组织的病理变化及牙周细胞的凋亡，此系通过调节RAGE-ROS信号通路发挥以上调节作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-6705-4869(杨娜)

关键词: 脂联素, 糖尿病, 牙周炎, RAGE-ROS通路, 牙周组织, 牙周细胞, 凋亡, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Low level of adiponectin plays a significant role in the occurrence and development of periodontitis and diabetes mellitus.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of adiponectin injection on diabetic periodontitis model mice and its mechanism.
METHODS: Sixty 8-week old Kunming mice (provided by Beijing Weitong Lihua Animal Experimental Technology Co., Ltd.) were randomly divided into three groups: control group, model group and adiponectin group. The mice in the model and adiponectin groups received intraperitoneal injection of streptozotin to establish a mouse model of diabetes mellitus, and then the periodontitis model was established by applying the combined bacterial fluid to the ligation site. The mice in the control and model groups received intraperitoneal injection of 1 mL normal saline once daily, while adiponectin group received intraperitoneal injection of 15 μg/kg adiponectin once daily, for 6 consecutive weeks. The three experimental groups of mice were treated for 6 weeks, after which physiological and biochemical indicators were tested. The levels of adiponectin in serum and periodontal tissue, the blood sugar and plasma insulin levels were then detected by ELISA. The depth of periodontal examination and the vertical absorption of alveolar bone were observed. The pathological changes of periodontal tissue were detected by hematoxylin-eosin staining. The changes of apoptosis level of gingival epithelial cells were detected by TUNEL method. The expression levels of RAGE and reactive oxygen species mRNA and protein were detected by RT-PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The levels of adiponectin in serum and periodontal tissue in the adiponectin group were significantly higher than those in the control and model groups (P < 0.05). (2) The blood sugar level in the adiponectin group was significantly lower than that in the model group (P < 0.05) and the serum insulin level was significantly increased (P < 0.05). (3) The depth of periodontal examination and vertical absorption of alveolar bone were decreased significantly in the adiponectin group compared with the model group, and the apoptotic rate of gingival epithelial cells was decreased significantly. (4) The expression levels of RAGE and reactive oxygen species mRNA and protein in the adiponectin group were significantly lower than those in the model group (P < 0.05). (5) These results suggest that adiponectin can improve the adiponectin level in periodontal tissue and plasma in the diabetic periodontitis model mice and can significantly improve the blood sugar status, and reduce the pathological changes of periodontal tissue and the apoptosis of periodontal cells possibly via regulating RAGE-ROS signaling pathway.

Key words: adiponectin, diabetes mellitus, periodontitis, RAGE-ROS signaling pathway, periodontal tissue, periodontal cells, apoptosis, tissue construction

中图分类号:

R496
R318

杨娜, 鲍萍萍, 雷涛. 脂联素干预糖尿病牙周炎模型小鼠牙周组织及血浆中的脂联素水平[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(23): 3692-3697.

Yang Na, Bao Pingping, Lei Tao. Adiponectin levels in plasma and periodontal tissue of mouse models of diabetic periodontitis treated by adiponectin [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(23): 3692-3697.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验选用小鼠60只，分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 造模后小鼠及其牙周组织情况正常对照组小鼠在实验期间未加以任何干预措施，小鼠状态始终保持活跃，食欲较好，反应灵敏，体质量逐渐增加。模型组首先干预的是注射链脲佐菌素，在注射药物3 d后血糖值明显升高，辅料明显较湿，此后更换频率明显加快。约7 d时出现多饮、多食、多尿、毛色晦暗、体型逐渐消瘦等典型的糖尿病症状。在实验开始前，观察各组小鼠上颌第1磨牙牙周组织状况均为正常状态，无炎症改变，可作为正常对照组来参考。模型组小鼠，结扎区牙位(上颌第1磨牙)经结扎3 d后出现了明显的牙周炎症表现，牙周红肿、探诊易出血，5 d后可探及较深的牙周袋，牙齿呈略微的松动状态，并可见牙根暴露。

2.3 血清和牙周组织中脂联素水平与正常对照组相比，糖尿病牙周炎模型组中小鼠血清和牙周组织脂联素的表达水平显著较低；而经过脂联素干预治疗的脂联素组中小鼠的脂联素水平则显著高于模型组和正常对照组(P < 0.05)，见表2，图1。

2.4 血糖和胰岛素水平与正常对照组相比，模型组中小鼠血液中血糖浓度显著高于正常对照组；而经过脂联素组中小鼠的血糖浓度则显著低于模型组。模型组小鼠的空腹胰岛素的水平显著低于正常对照组，经过脂联素干预治疗之后小鼠的胰岛素水平明显升高(P < 0.05)，见表3，图2。

2.5 牙周探诊深度与牙槽骨垂直吸收高度模型组小鼠的牙周探诊深度和牙槽骨垂直吸收高度均显著高于正常对照(P < 0.05)；脂联素组中小鼠的牙周探诊深度和牙槽骨垂直吸收高度均显著低于模型组，但仍高于正常对照组(P < 0.05)，见表4，图3。

2.6 牙周组织病理学变化苏木精-伊红染色观察显示，与正常对照组比较，模型组牙周结扎6周后，牙龈乳头丧失，并向根方退缩，胶原纤维溶解丧失，大量炎症细胞浸润，牙槽嵴顶重度降低。而脂联素组中的小鼠较模型组，牙龈乳头丧失较少，且只有少量的胶原纤维降解，炎性细胞少量浸润。见图4。

2.7 牙周组织细胞凋亡情况变化经过TUNEL染色处理后，模型组小鼠牙周组织细胞的凋亡率显著高于正常对照组[(45.71±3.41)%，(6.32±0.21)%，P < 0.05]。6周治疗后，脂联素组小鼠的牙周组织细胞凋亡率显著降低[(18.31± 0.73) %，P < 0.05]。见图5。

2.8 RAGE蛋白和基因表达水平模型组小鼠牙周组织中的RAGE及活性氧的蛋白和基因相对表达水平均显著高于正常对照组(P < 0.05)。脂联素组小鼠牙周组织中的RAGE及活性氧的蛋白和基因的相对表达水平均显著低于模型组，见表5，图6。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年5月至2018年1月在天津医科大学总医院实验动物中心实验室完成。

1.3 材料胰蛋白酶由美国Sigma公司购进；PBS磷酸缓冲液由Hyclone提供，脂联素的ELISA试剂盒购自上海隆垒生物科技有限公司。

60只8周龄体质量为20 g的昆明系小鼠，雌雄小鼠各占50%，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，实验动物使用许可证号：SYXK(津)2014-0002。实验用的所有昆明系小鼠均饲养在于室温25 ℃，湿度60%-70%的SPF环境下，同时给予小鼠以自由方便的饮水和采食。

1.4 实验方法

1.4.1 糖尿病牙周炎模型构建与分组将60只小鼠平均随机分为正常对照组和病理模型组以及脂联素干预治疗的脂联素组3个组。其中模型组和脂联素组中所有小鼠均接受一次性的链脲佐菌素(150 mg/g)腹腔内注射从而建立小鼠糖尿病模型；随后对小鼠牙周局部进行丝线结扎手术，并于结扎部位涂抹联合菌液以建立小鼠牙周炎模型。

1.4.2 判断模型建立是否成功及处理 ①建模后检测模型组和脂联素组小鼠72 h后空腹血糖水平>11.1 mmol/L为小鼠的糖尿病模型建立成功；②观察模型组和脂联素组中小鼠牙龈组织的炎症出现红肿、探针探查易出血判断牙周炎模型建模成功。检测结果表明模型组和脂联素组小鼠的糖尿病牙周炎模型建立成功。

正常对照组和糖尿病牙周炎模型组小鼠每日1次接受 1 mL生理盐水腹腔注射，而脂联素干预的脂联素组小鼠则每日接受1次15 μg/kg的脂联素腹腔注射。3个实验组小鼠的干预治疗均持续6周，6周后进行生理生化指标的检测。

1.4.3 血清和牙周组织中生化指标水平检测干预治疗6周之后，于早上小鼠空腹状态下在各组中取5只小鼠麻醉并采集血液，随后处死小鼠取其右侧牙周组织进行生理生化指标的检测。3组小鼠的血糖水平和空腹状态下的胰岛素水平及血清和牙周组织中脂联素的表达水平均采用ELISA法进行检测。

1.4.4 牙周探诊深度与牙槽骨垂直吸收高度干预治疗6周之后，各个试验组中选择5只小鼠进行麻醉处理。采用Mazza法检测小鼠颊面近中、中央以及远中央牙周探诊深度，并计算其平均值作为小鼠牙周探诊深度值。随后取小鼠的牙槽骨，将其反复用水和体积分数3%双氧水清洗，经1%(质量分数)亚甲蓝(Sigma-Aldrich公司，美国)染色45 s，37 ℃烤箱干燥。在显微镜下测量小鼠上颌3个磨牙颊侧7个位点的CEJ-ABC距离，每个位点重复测量3次取平均值作为亚财股垂直吸收高度值。

1.4.5 牙周组织病理学检测麻醉并处死小鼠后取出其右侧下颌骨组织，用体积分数4%的甲醛溶液固定牙周组织以制备牙周组织切片；使用由低浓度到高浓度的乙醇作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水分。再将组织块置于既溶于乙醇，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中乙醇，随后进行浸蜡包埋。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成5-8 μm厚薄片。将薄片烫平，再贴到载玻片上，45 ℃恒温烘干。脱蜡后，进行苏木精-伊红染色。染色后的切片经纯乙醇脱水，再经二甲苯使切片透明。将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶干燥后，荧光显微镜下观察各组小鼠牙周组织形态变化。

1.4.6 TUNEL检测牙周组织细胞凋亡取3个处理组小鼠的右侧牙周组织制作石蜡切片后脱蜡处理，向切片上滴加复合消化酶进行室温20 min的孵化；洗涤之后滴加50 μL的TUNEL标记反应混合液并在湿盒中37 ℃孵育约 60 min，随后滴加POD2转化液50 μL；湿盒37 ℃孵育 30 min，PBS冲洗3次，DAB显色；进行苏木精-伊红复染后即可在荧光显微镜下观察计数，比较牙周组织切片中的凋亡细胞数目，据此计算牙周组织细胞的凋亡率。

1.4.7 RAGE-ROS信号通路基因表达水平检测干预治疗6周之后，从各组分别取5只小鼠同一部位的牙周组织置于液氮中准备测定牙周组织中晚期糖基化终末产物(advanced glycationend products，AGEs)受体基因相对表达。每个检测重复3次。取出牙周组织，于冰上充分研磨组织后迅速加入TRIzol试剂裂解细胞抽提总RNA。根据反转录说明书合成相应的cDNA并进行扩增。反应总体系15 μL(SYBR Green 3 μL、DEPC水10 μL、上下引物各0.5 μL、cDNA 200 mg/L 1 μL)。扩增条件均为94℃预变性1 min，94 ℃变性30 s， 59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33个循环。采用2^-^??Ct分析法，以GAPDH基因作为内参，测定RAGE和活性氧的mRNA相对表达水平。引物序列见表1。

1.4.8 RAGE-ROS信号通路蛋白表达水平检测治疗6周后分别从3组各取出5只小鼠，并取出所有小鼠同一部位的牙周组织测定牙周组织中RAGE-ROS信号通路蛋白相对表达水平。将细胞裂解之并将之稀释至相同的蛋白浓度，100℃煮沸5 min使蛋白变性。每组取蛋白40 μg，10%SDS-PAGE凝胶电泳(70 V，30 min；100 V，90 min)；转膜(200 mA，3 h)至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭2 h (或4 ℃过夜)；一抗1∶500，室温孵育2 h (或4 ℃过夜)；TPBS洗涤3次，PBS洗涤1次；之后进行蛋白免疫印迹的反应，拍照记录之后进行软件的图像分析，测定各组牙周损伤组织中RAGE蛋白相对表达。

1.5 主要观察指标 ①血清及牙周组织中脂联素的水平；②血糖及血浆胰岛素的水平；③小鼠的牙周探诊深度以及牙槽骨垂直吸收高度；④牙周组织病理变化；⑤牙龈上皮细胞凋亡水平，⑥RAGE、活性氧基因和蛋白表达。

1.6 统计学分析首先，将所有试验数据输入Excel 2010表格中，之后用生物统计学软件SPSS 16.0进行统计分析；所有数据资料的组间比较采用单因素方差分析，结果数据以x(_)±s表示，并规定P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

糖尿病是近年来最为常见的慢性代谢疾病之一，因其对机体全身系统的影响而常常伴发一些并发症。牙周炎的发生诱因是菌斑对牙周组织的入侵，进而引发炎症反应^[9]。研究已经证实，糖尿病和牙周炎二者之间具有双向促进的作用。牙周炎引起的牙周组织的局部炎症可能会加剧糖尿病患者全身性的炎症反应，加重糖尿病的发生和发展进程。而糖尿病可以改变致病菌对患者的机体免疫细胞和免疫因子的应答，加重牙周疾病的进程^[10]，并通过影响患者牙龈组织内核因子κB受体活化因子配体和骨保护素的表达水平，抑制牙周组织中骨的新生和修复，加剧牙周炎的发生^[11]。此外糖尿病患者机体内显著升高的糖基化终末产物还会激活患者机体内的核因子κB信号准到通路从而启动炎症反应，加剧牙周炎的免疫反应并影响牙周组织内骨的吸收和修复^[12-13]。

研究显示脂联素可以提高患者胰岛素的敏感性，调节机体内糖和脂肪的代谢平衡并对缓解糖尿病的发生有积极作用^[14-15]。高糖环境刺激下，患者细胞中活性氧自由基的产生明显增多，激活炎症反应通路并提高了细胞中免疫因子的水平；而较高水平的脂联素干预则可以明显抑制肿瘤坏死因子α等炎性因子的分泌，从而降低炎症反应^[16-18]。已有研究表明，糖尿病牙周炎发生后患者牙周组织中脂联素水平显著降低，脂联素水平的下降也被认为是引发牙周炎发病和加重的原因之一。

研究结果表明，脂联素干预治疗之后小鼠体内血糖和空腹状态下胰岛素的水平显著降低。由此可知脂联素的干预治疗明显地缓解了病理模型小鼠的糖尿病进程。糖尿病牙周炎模型组小鼠的牙周探诊深度和牙槽骨垂直吸收高度均显著高于正常对照组；经过腹腔注射脂联素后小鼠的牙周探诊深度和牙槽骨垂直吸收高度均得以明显的降低。与模型小鼠相比，经过脂联素治疗的小鼠牙龈乳头丧失较少，且只有少量的胶原纤维降解，炎性细胞少量浸润。此可知脂联素的干预显著改善了小鼠的骨的吸收和新生，促进了牙周组织骨的修复。此外TUNEL检测结果也表明脂联素干预明显抑制了牙龈上皮细胞的凋亡，并显著缓解了牙龈的损伤。

高糖状态下，患者机体内的晚期糖基化终末产物生成显著增多并逐渐堆积，会刺激其相应受体的活化和表达水平上调^[19-20]。晚期糖基化终末产物与免疫细胞表面的RAGE结合后可以激活炎症反应信号转导通路，促进炎症的发生^[21]。此外AGE-RAGE的相互作用还可以抑制骨的新生和修复，促进破骨细胞的成熟，从而影响牙周炎患者牙周组织中骨的修复^[22]。RAGE与晚期糖基化终末产物相互作用能促进还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的激活^[23]，导致细胞氧化-抗氧化防御系统失衡，造成活性氧生成增多，促进炎性递质释放，参与牙周炎发生、发展^[24-25]。

脂联素的表达由多种因素调控，其在多种生理病理过程中起重要作用^[26-28]。脂联素主要有2种受体ADPR1和ADPR2，这2种受体在所有组织器官中均有表达。有研究表明，脂联素功能的降低可能加重牙周病的发展^[29-30]。此次研究结果显示，脂联素干预治疗可以降低模型小鼠晚期糖基化终末产物受体和活性氧的生成。由此可知，脂联素可以通过降低RAGE的表达和活性氧的生成，缓解炎症反应，促进骨的修复再生，并缓解氧化应激反应。

脂联素干预治疗可以明显升高糖尿病牙周炎模型小鼠牙周组织及血浆的脂联素水平并可以改善糖尿病小鼠的血糖状态；并可以减轻模型小鼠牙周组织的病理变化以及牙龈上皮细胞的凋亡，这些治疗作用可能是通过调节RAGE-ROS信号转导通路实现的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程